Hesaplamalı araştırma makalesi incelemesi

MetaPhlAn 4 Kullanılarak Karakterize Edilmemiş Türler İle Metagenomik Taksonomik Profillemenin Genişletilmesi ve Geliştirilmesi

Shotgun metagenomik dizileme yöntemleri, karmaşık mikrobiyal toplulukların taksonomik bileşimini ve fonksiyonel potansiyelini incelemek için temel bir araç haline gelmiştir. Bu durum, mikrobiyom verilerinin anlamlandırılmasında büyük bir veri kaybına yol açmaktadır.

Makalenin anahtar kelimeleri

Yazar: Blanco-Míguez A et al.
Yayın
Tarih: 2023-02-23
DOI: 10.1038/s41587-023-01688-w

Makalenin Kapsamı ve Akademik İçeriği

Shotgun metagenomik dizileme teknolojileri, mikrobiyom araştırmalarında topluluk yapısının ve işlevsel potansiyelin çözümlenmesi için standart yöntem haline gelmiştir. Ancak geleneksel referans tabanlı taksonomik profilleme yazılımları, yalnızca kültürlenmiş ve veritabanlarına kaydedilmiş izolat genomlarına dayandığı için metagenomik okumaların önemli bir kısmını tanımlayamamakta ve mikrobiyel karanlık madde olarak adlandırılan henüz karakterize edilmemiş organizmaları göz ardı etmektedir. Öte yandan de novo birleştirme yaklaşımları yeni türlerin keşfine imkân tanısa da düşük bolluktaki taksonlarda hassasiyet kaybı yaşamakta ve genom birleştirme hatalarına açık kalmaktadır. Bu metodolojik ikilem, özellikle insan bağırsak mikrobiyomu dışındaki çevrelerde ve izole edilmemiş türlerin yoğun olduğu karmaşık ekosistemlerde nicel verilerin tam olarak elde edilmesini engellemektedir.

Sunulan bu çalışmada, metagenom birleştirme verileri ile izole mikrobiyal genom dizilerini ortak bir sistemde birleştiren MetaPhlAn 4 yöntemi geliştirilmiştir. Araştırmacılar, 1.01 milyon bakteriyel ve arkasal genom ile metagenomla monte edilmiş genomu (MAG) kalite kontrolden geçirerek yüzde beş sekans benzerliği eşiğinde 70.927 tür düzeyinde genom kutusu (SGB) tanımlamıştır. Bu kutuların 21.978'i bilinen türleri (kSGB), 4.992'si ise en az beş farklı örnekte tespit edilmiş henüz tanımlanmamış tür adaylarını (uSGB) temsil etmektedir. Pangenom analizi ve hizalama adımlarıyla bu SGB'ler için 5.1 milyon benzersiz işaretçi gen belirlenmiş; geliştirilen haritalama algoritması sayesinde yeni metagenomik okumaların hem bilinen hem de kültürlenmemiş türlere yüksek hassasiyetle atanması sağlanmıştır.

133 sentetik ve 24.500'den fazla gerçek metagenom örneği üzerinde yürütülen değerlendirmelerde MetaPhlAn 4, mevcut profilleme araçlarına (MetaPhlAn 3, mOTUs 2.6, Bracken 2.5) kıyasla F1 skoru, Bray-Curtis benzerliği ve kestirim kesinliğinde belirgin bir üstünlük sergilemiştir. Yöntem, uluslararası insan bağırsak mikrobiyomu veri kümelerinde açıklanan okuma oranını yaklaşık yüzde 20 artırırken, işkembeli hayvan mikrobiyomu gibi az karakterize edilmiş çevrelerde bu oranı yüzde 40'ın üzerine çıkarmıştır. Ayrıca ZOE PREDICT 1 verilerinin re-analizinde, kardiyometabolik risk faktörleri ve diyet indeksleri ile güçlü ilişki gösteren 20 yeni tanımlanmamış tür (uSGB) saptanmış, StrainPhlAn 4 uzantısı ile bu izole edilmemiş organizmaların suş düzeyinde genetik çeşitliliği ve filogenetik yapısı başarıyla haritalandırılmıştır.

Elde edilen bulgular, mikrobiyom analizi literatüründe kültürlenmemiş organizmaların nicelleştirilmesinin konakçı fizyolojisi ve hastalık biyobelirteçlerinin saptanmasındaki kritik rolünü göstermektedir. MetaPhlAn 4, genomik veri tabanlarının izolat bağımlılığını kırarak metagenomik analizlerde veri kaybını minimize etmekte ve mikrobiyel ekolojide yeni hipotezlerin test edilmesine olanak tanımaktadır. Bu metodolojik ilerleme, metagenomik veri işleme hatlarında taksonomik çözünürlüğü artırmak isteyen araştırmacılar için güçlü bir altyapı sunmakta; özellikle diyet, epidemiyoloji ve evrimsel mikroepidemiyoloji çalışmalarında henüz adı konmamış türlerin fonksiyonel rollerinin incelenmesine zemin hazırlamaktadır.

Araştırmanın amacı

Bu çalışmanın amacı, metagenom birleştirme verileri ile izole mikrobiyal genom dizilerini entegre ederek hem bilinen hem de henüz karakterize edilmemiş taksonları yüksek hassasiyetle tanımlayan ve nicelleştiren MetaPhlAn 4 yöntemini geliştirmek ve doğrulamaktır(A et al., 2023).

İnceleme ve modelleme yöntemi

Hesaplamalı metagenomik analiz yaklaşımı temelinde, izolat genomları ile metagenomik birleştirme sonuçu elde edilen genomlar (MAG) tür düzeyinde genom kutuları (SGB) altında entegre edilerek benzersiz işaretçi genler çıkarılmış ve haritalama tabanlı profilleme gerçekleştirilmiştir(A et al., 2023).

Kuramsal ve kavramsal çerçeve

Çalışmanın kuramsal çerçevesi, mikrobiyoloji ve biyoinformatikteki tür düzeyinde genom kutuları (Species-level Genome Bins - SGB) kavramına dayanmaktadır. Bütüncül genomik dizileme verilerinin yüzde beş genetik uzaklık eşiğinde kümelenmesi esasına dayanan bu yaklaşım, biyolojik tür sınırlarını izolat varlığından bağımsız olarak temsil etmeyi mümkün kılar. Hesaplamalı genomik analizler ve pangenom türetme teorisi çerçevesinde benzersiz işaretçi genlerin belirlenmesi, referans tabanlı profillemenin yüksek hassasiyetini de novo birleştirmenin kapsam genişliğiyle birleştirmektedir.

Makalenin ele aldığı literatür

Çalışma, geleneksel referans veritabanı profilleme yöntemlerinin (MetaPhlAn 3, mOTUs2, Bracken) bilinen organizmalarla sınırlı kalması sorununu ele almaktadır. De novo metagenomik birleştirme (MAG) veritabanlarının (CAMI 2, GTDB, RefSeq) son dönemdeki hızlı büyümesine rağmen, bu geniş genom koleksiyonlarının doğrudan profilleme araçlarına entegre edilmesindeki yetersizlikler vurgulanmaktadır. Makale, mikrobiyom çeşitliliğinin büyük bir kısmının haritalanamayan okumalarda kaybolduğu yönündeki literatür tartışmalarına doğrudan odaklanmaktadır.

Araştırma Tasarımı

Evren veya inceleme alanı: 236.620 bakteri ve arkeden oluşan izole genomlar ile insan, hayvan ve çevre örneklerinden elde edilmiş 771.528 metagenom birleştirmeli genom (MAG) derlemi.
Örneklem veya araştırma materyali: 1,01 milyondan fazla prokaryotik genom dizisi, 133 sentetik metagenomik değerlendirme kümesi ve 145 farklı çalışmadan elde edilen 24.515 gerçek metagenomik veri seti.
Veri toplama süreci: NCBI GenBank veritabanındaki izolat genomları, kamuya açık dizi arşivlerinden toplanan ham metagenomik okumalar ve küresel ölçekteki insan, hayvan ile çevresel mikrobiyom örneklerinin dizileme verileri.
Veri analiz yöntemi: CheckM ile kalite kontrolü, Mash ile %5 genetik uzaklık eşiğinde hiyerarşik kümeleme, UniRef90 ve MMseqs2/UniClust90 ile pangenom oluşturma, Bowtie 2 ile dizi hizalama ve haritalama tabanlı bağıl bolluk kestirimi.

Tür düzeyinde genom kutusu (SGB)Karakterize edilmemiş tür (uSGB)Benzersiz işaretçi gen (Marker gene)Taksonomik profilleme (Taxonomic profiling)Suş düzeyinde genotiplendirme (Strain-level profiling)

Araştırmanın Bulguları

MetaPhlAn 4, 21.978 bilinen tür (kSGB) ve 4.992 tanımlanmamış tür (uSGB) dâhil olmak üzere toplam 26.970 yüksek kaliteli tür düzeyi kutu için 5,1 milyon benzersiz işaretçi gen tanımlayarak taksonomik profilleme veritabanını genişletmiştir(A et al., 2023).

133 sentetik metagenomik veri kümesinde gerçekleştirilen kıyaslama değerlendirmelerinde MetaPhlAn 4, hem takson tespiti duyarlılığında (F1 skoru) hem de niceliksel bolluk kestiriminde (Bray-Curtis benzerliği) alternatif araçlara kıyasla daha yüksek performans göstermiştir(A et al., 2023).

Küresel ölçekteki 24.515 gerçek metagenomik örneğin analizinde MetaPhlAn 4, özellikle insan solunum yolu, ruminant ve çevresel örneklerde haritalanabilir ve açıklanabilir okuma oranlarını önemli ölçüde artırmıştır(A et al., 2023).

ZOE PREDICT 1 müdahale çalışması verilerinin yeniden analizi, henüz tanımlanmamış türlerin (uSGB) kanda kardiyometabolik sağlık parametreleri ve diyet indeksleri ile yüksek korelasyon sergileyen güçlü biyobelirteçler olduğunu ortaya koymuştur(A et al., 2023).

StrainPhlAn 4 altyapısı, bilinen türlerin yanı sıra izole kültürü bulunmayan uSGB türlerinde de tekil suş düzeyinde genotiplendirme ve coğrafi konuma dayalı filogenetik analiz yapılmasına olanak tanımıştır(A et al., 2023).

Bulguların Tartışılması ve Araştırmanın Sonucu

Bulguların Yazarlar Tarafından Yorumlanışı

Çalışmanın ampirik bulguları, MetaPhlAn 4'ün tür düzeyinde genom kutuları (SGB) stratejisini kullanarak 4.992 adet henüz tanımlanmamış mikrobiyal türü (uSGB) niceliksel profillemeye dâhil ettiğini ve alternatif biyoinformatik araçlara kıyasla hem F1 tespit skorunda hem de bağıl bolluk kestiriminde daha üstün bir performans sergilediğini göstermektedir.

Yazarlar elde edilen bu performansı, 1 milyondan fazla izolat ve MAG dizisinin tutarlı bir %5 genetik benzerlik eşiğiyle SGB'ler altında gruplandırılmasına ve bu sayede yanlış sınıflandırılmış referans dizilerin ayıklanarak daha özgün ve geniş bir işaretçi gen kütüphanesinin oluşturulmasına bağlamaktadır.

Tartışma bölümünde bu sonuçlar, daha önce yalnızca izole kültür referanslarına dayanan MetaPhlAn 3, mOTUs ve Bracken gibi yöntemlerle karşılaştırılmış; MetaPhlAn 4'ün insan harici ve az karakterize edilmiş çevresel mikrobiyomlardaki açıklanan okuma oranını 2 ila 14 kat artırarak literatürdeki kapsama eksikliğini kapattığı belirtilmiştir.

Sonuç olarak, metagenom birleştirme ile referans tabanlı haritalama ilkelerinin birleştirilmesi, mikrobiyom analizlerinde bilinmeyen organizma kesiminin kardiyometabolik sağlık ve diyetle doğrudan ilişkili güçlü biyobelirteçler barındırdığını kanıtlamakta ve gelecekteki geniş ölçekli epidemiyolojik mikrobiyom araştırmaları için bütüncül bir standart sunmaktadır.

Bulguların Önceki Araştırmalarla Karşılaştırılması

MetaPhlAn 3 ve bioBakery 3 çerçevesi yalnızca tanımlı izolat genomlarına dayanırken, MetaPhlAn 4 birleştirme tabanlı MAG dizilerini altyapısına dâhil ederek haritalanabilir okuma oranını artırmış ve F1 takson saptama skorunda önceki sürüme üstünlük sağlamıştır(A et al., 2023).

Sonuç Bölümünün Sunduğu Çıkarımlar

Yazarlar, MetaPhlAn 4 yönteminin metagenom birleştirme ve referans tabanlı profilleme yaklaşımlarını başarılı bir şekilde bir araya getirerek mikrobiyom araştırmalarındaki tanımlanmamış organizma eksikliğini giderdiğini vurgulamaktadır. Gelinen noktada, henüz izole edilmemiş ve adı konmamış türlerin tespit edilmesi, mikrobiyomun konakçı sağlığı, beslenme ve hastalık süreçlerindeki rolünün daha hassas bir şekilde anlaşılmasını ve yüksek çözünürlüklü suş takibi yapılabilmesini sağlamaktadır(A et al., 2023).

Literatür Taraması İçin Sunduğu Çerçeve

Bu makale mikrobiyom literatüründe referans veritabanlarının kısıtlılığını de novo metagenomik birleştirme yöntemlerinin duyarlılık eksikliği ile dengeleyen hibrit bir taksonomik profilleme yaklaşımı sunmaktadır. Geliştirilen MetaPhlAn 4 aracı, mevcut izolat referanslarının ötesine geçerek henüz laboratuvar ortamında izole edilememiş ve isimlendirilmemiş milyonlarca mikrobiyal diziyi tür düzeyinde genom kutuları (SGB) altında organize etmektedir. Böylece, mikrobiyom çalışmalarında 'karanlık madde' olarak adlandırılan ve standart haritalama yöntemleriyle gözden kaçan uncharacterized (karakterize edilmemiş) organizmaların bağıl bolluklarının ve suş düzeyindeki varyasyonlarının hassas bir şekilde takibini mümkün kılarak literatürdeki metodolojik bir boşluğu doldurmaktadır.

Çalışma, yazarların daha önceki çalışmaları olan ve standart taksonomik referanslara dayanan MetaPhlAn 3 ve Pasolli ve arkadaşlarının (2019) öncülük ettiği SGB konsepti üzerine inşa edilmiştir. Önceki referans tabanlı profilleme araçları (Bracken ve mOTUs gibi) yalnızca kültürlenmiş izolatlardan elde edilen genom veritabanlarını kullanabilirken, bu çalışma 1 milyondan fazla prokaryotik genomu bir araya getirerek veritabanı ölçeğini 4.3 kat genişletmiştir. Bu genişleme sayesinde, daha önceki sürümlerin aksine, genomik olarak tanımlı fakat taksonomik olarak bilinmeyen (uSGB) klanlar için de core (çekirdek) işaretçi genlerin türetilmesi sağlanmış, böylece referans tabanlı yöntemlerin yüksek seçiciliği ile de novo birleştirme yöntemlerinin keşif potansiyeli birleştirilmiştir.

Mikrobiyom literatürü taramalarında bu makale, konakçı sağlığı ve yaşam tarzıyla ilişkili mikrobiyal belirteçlerin kapsamını genişleten kritik bir referans kaynağı işlevi görmektedir. Özellikle batılılaşmış ve geleneksel topluluklar arasındaki mikrobiyom profili farklarını, daha önce tespit edilemeyen uncharacterized klanları (uSGB) da dahil ederek detaylandırmaktadır. Bu durum, mikrobiyom-diyet-metabolizma eksenindeki ilişkilendirmelerin açıklayıcılık gücünü artırmaktadır. Araştırmacılar, derleme ve tarama çalışmalarında bu makaleyi referans alarak geleneksel veritabanı kısıtlarının mikrobiyom keşiflerini nasıl gölgelediğini ve MetaPhlAn 4'ün sağladığı %20 ila %40 oranındaki ek okuma açıklama kapasitesinin epidemiyolojik çalışmalarda neden devrimsel bir adım olduğunu gerekçelendirebilirler.

Kaynakça

Beghini, F., McIver, L. J., Blanco-Miguez, A., Believe, L., Asnicar, F., Piperni, E., ... & Segata, N. (2021). Integrating taxonomic, functional, and strain-level profiling of diverse microbial communities with bioBakery 3. eLife, 10, e65088.

Tez ve Makale Araştırmalarında Kullanım

Makalenin doğrulanmış yöntemi, bulguları ve kuramsal çerçevesi; tez ve makale çalışmalarında kullanılacağı bölümle birlikte aşağıdaki üç araştırma taslağına dönüştürülmüştür.

Tez veya makalede kullanım · literatüre-review

Geleneksel referans veritabanlarının kullanımı mikrobiyom analizlerinde ciddi bir veri kaybına ve uncharacterized taksonların gözden kaçmasına sebep olmaktadır.

MetaPhlAn 4'ün standart insan dışı mikrobiyomlarda (örneğin ruminant mikrobiyomu) haritalanabilir okuma oranını yüzde kırkın üzerinde artırdığı bulgusu, geleneksel veritabanı kısıtlılığını vurgulamak için kullanılır(A et al., 2023).

Tip 2 Diyabetli Türk Hastalarda Henüz Karakterize Edilmemiş Bağırsak Mikrobiyal Türlerinin (uSGB) Klinik Korelasyonu

Araştırma sorusu: Tip 2 diyabet hastalarının bağırsak mikrobiyomunda, sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında anlamlı derecede farklılık gösteren ve MetaPhlAn 4 ile tanımlanan uncharacterized (uSGB) taksonlar hangileridir?
Yöntem taslağı: Metagenomik shotgun dizileme yöntemiyle yürütülecek vaka-kontrol çalışmasında, en az 50 Tip 2 diyabetli hasta ve 50 sağlıklı kontrolün dışkı örnekleri analiz edilecektir. Örneklem büyüklüğü güç analiziyle doğrulanacaktır. Veriler MetaPhlAn 4 ile profillenecek, uSGB bağıl bollukları ve klinik HbA1c, açlık kan şekeri parametreleri arasındaki ilişkiler çok değişkenli lineer mikst modeller ile incelenecektir.

Makaleyle bağlantısı: Makalenin ZOE PREDICT 1 veri setinde uSGB'lerin metabolik sağlık parametreleri ve kan lipidleri ile en güçlü korelasyonu gösteren biyobelirteçler olduğu yönündeki ampirik bulgusundan türetilmiştir. Bu bulgu, diyabet gibi yaygın metabolik hastalıklarda uSGB'lerin potansiyel tanısal değerini araştırmayı rasyonel kılmaktadır(A et al., 2023).

Tez veya makalede kullanım · method

Tür düzeyinde mikrobiyal kümeleme ve suş seviyesinde filogenetik analizler için SGB bazlı işaretçi gen haritalaması kullanılmalıdır.

Çalışmanın metagenom okumalarını SGB işaretçi gen veri tabanına Bowtie 2 ile hizalayarak bağıl bolluk ve StrainPhlAn suş takibi yapma metodolojisi tez yöntem bölümünde referans gösterilir(A et al., 2023).

Farklı Coğrafi Bölgelerdeki Türk Popülasyonunda Lachnospiraceae SGB4894 Suşlarının Filogenetik ve Coğrafi Uzaklık Analizi

Araştırma sorusu: Türkiye'nin farklı coğrafi bölgelerinde yaşayan sağlıklı bireylerden izole edilen Lachnospiraceae SGB4894 suşları coğrafi izolasyon (isolation-by-distance) modeli sergilemekte midir?
Yöntem taslağı: Türkiye'nin 7 coğrafi bölgesinden seçilecek sağlıklı 140 yetişkin bireyden (her bölgeden 20 birey; veri doygunluğu gözetilerek) shotgun metagenom verisi toplanacaktır. StrainPhlAn 4 aracı kullanılarak SGB4894 suşlarının genotipleri çıkarılacak ve filogenetik uzaklıklar ile bireylerin coğrafi konumları (kilometre cinsinden) arasındaki Spearman korelasyonu test edilecektir.

Makaleyle bağlantısı: Yazarın Lachnospiraceae SGB4894 suşlarının küresel ölçekte coğrafi konuma ve yaşam tarzına göre net filogenetik subclade'ler oluşturduğu ve isolation-by-distance deseni gösterdiği yönündeki bulgusuna dayanmaktadır. Bu durum yerel popülasyonlarda coğrafi evrimin izlenmesi için güçlü bir zemin sunar(A et al., 2023).

Tez veya makalede kullanım · Tartışma

Henüz laboratuvarda kültüre edilmemiş mikrobiyal taksonlar (uSGB), konakçının beslenme tarzı ve kardiyometabolik sağlığı ile doğrudan ilişkilidir.

Yeniden analiz edilen ZOE PREDICT 1 verilerinde en güçlü diyet ve sağlık korelasyonlarının uSGB klanlarında saptanmış olması bulgusu, deneysel klinik bulguların tartışılmasında kullanılır(A et al., 2023).

Geleneksel Anadolu Diyeti Uygulayan Bireylerde Bağırsak Mikrobiyomunun uSGB Richness Değişiminin İncelenmesi

Araştırma sorusu: Akdeniz tipi Geleneksel Anadolu diyeti ile beslenen bireylerin bağırsak mikrobiyomundaki uncharacterized türlerin (uSGB) zenginliği (richness) ve bağıl bolluğu, batı tipi diyetle beslenenlere kıyasla nasıl değişmektedir?
Yöntem taslağı: Kesitsel bir kohort çalışmasında, geleneksel kırsal Anadolu diyeti uygulayan 60 birey ve şehir merkezinde batı tipi beslenen 60 bireyin dışkı örneklerinden shotgun metagenom dizileme yapılacaktır. MetaPhlAn 4 kullanılarak uSGB zenginliği ve Alfa/Beta çeşitlilik indeksleri hesaplanacak, diyet anketleri (FFQ) skorları ile uSGB bollukları arasındaki ilişkiler dezentralize edilmiş regresyon modelleriyle test edilecektir.

Makaleyle bağlantısı: Yazarların batılılaşmamış (nonwesternized) popülasyonlarda uSGB zenginliğinin ve bolluğunun batılılaşmış popülasyonlara göre anlamlı derecede yüksek olduğu ve bu uncultivated türlerin geleneksel diyetlerle güçlü ilişkisi bulunduğu saptamasından türetilmiştir. Anadolu diyetinin koruyucu etkisini anlamak açısından kritiktir(A et al., 2023).