Deniz ekosistemlerinin biyotik dengesi, besin zincirinin orta trofik seviyesinde yer alan Avrupa hamsisi gibi yüksek biyokütle üretkenliğine sahip türlerin üreme başarısına bağımlıdır. Hamsi, kısa yaşam süresine rağmen sergilediği yüksek fekondite, erken olgunlaşma ve geniş beslenme yelpazesi ile ekolojik bir başarı örneği sunmaktadır. Balıklarda oogenez ve yumurta üretimi evrensel bir model izlese de türler arasında yumurta sayısı ve yumurtlama sıklığı bakımından devasa farklar bulunmaktadır. Bu çalışma, hamsinin ovaryum dokusundaki karmaşık hücre etkileşimlerini ve bu süreçlerin ardındaki moleküler ağları aydınlatarak teleost üreme biyolojisine dair derinlemesine bir perspektif sunmayı amaçlayan bir sorunsal üzerine inşa edilmiştir.
Araştırmada yöntemsel olarak, Avrupa hamsisinin ovaryum, testis, karacığer, böbrek, solungaç, yüzgeç ve kuyruk dokuları ile juvenil bireylerinden elde edilen 102,3 milyar temiz bazlık devasa bir RNA sekanslama verisi kullanılmıştır. De novo transkriptom montajı sonrasında, farklı fekondite oranlarına sahip yedi teleost türüyle karşılaştırmalı evrimsel analizler gerçekleştirilmiştir. Ortolog genlerin belirlenmesinde ve hamsiye özgü pozitif seçilim sinyallerinin saptanmasında branch-site dN/dS testleri ve PAML paketi uygulanmış; doku bazlı diferansiyel gen ekspresyon analizleri DESeq2 yöntemiyle yürütülerek seçilim altındaki genlerin fonksiyonel yansımaları biyoinformatik araçlarla çözümlenmiştir.
Analiz sonuçları, Avrupa hamsisinde tek kopyalı 2.272 ortolog genden 535 tanesinin pozitif seçilim altında olduğunu ortaya koymuştur. Bu genlerin RNA metilasyonu, ribozom biyogenezi, DNA onarımı ve hücre döngüsü işleme gibi kritik hücresel fonksiyonlarla ilişkili olduğu saptanmıştır. Ovaryum dokusuna odaklanıldığında, pozitif seçilim altındaki genlerin 58'inin anlamlı düzeyde yüksek ekspresyon (upregulation) gösterdiği belirlenmiştir. Özellikle pnisr, prrc2b ve cdc6 gibi genlerin en belirgin seçilim sinyallerini taşıdığı ve bu genlerin oosit gelişimi ile embriyonik süreçlerdeki hücre bölünmesi ve farklılaşmasında hayati roller üstlendiği kanıtlanmıştır.
Çalışmanın tartışma ve sonuç bölümü, hamsideki yüksek üreme kapasitesinin sadece çevresel değil, derin evrimsel adaptasyonların bir sonuçu olduğunu göstermektedir. Pozitif seçilim altındaki genlerin büyük çoğunluğunun DNA bütünlüğünü koruma ve protein sentez kapasitesini artırma yönünde evrildiği vurgulanmaktadır. Yazarlar, elde edilen bu kapsamlı transkriptomik kaynağın, Clupeid balık türlerinin üreme biyolojisini anlamada ve teleostlarda yumurta üretim kapasitesini belirleyen genetik anahtarların keşfinde bir referans olacağını savunmaktadır. Bu bulgular, balıkçılık yönetimi ve denizel kaynakların korunması stratejileri için moleküler düzeyde somut ve özgün bir literatür katkısı sağlamaktadır.
Araştırmanın amacı
Bu araştırmanın temel amacı, Avrupa hamsisinin ovaryum transkriptom profilini kapsamlı doku spesifik analizlerle ortaya koymak ve farklı fekondite oranlarına sahip diğer teleost türleriyle karşılaştırmalı evrimsel analizler yürüterek yüksek üreme kapasitesiyle ilişkili pozitif seçilim sinyallerini ve bu genlerin fonksiyonel rollerini belirlemektir(Eldem et al., 2023).
İnceleme ve modelleme yöntemi
Çalışmada, Avrupa hamsisinin (E. encrasicolus) çeşitli dokularından (ovaryum, testis, karacığer, böbrek, solungaç, yüzgeç, kas ve kuyruk) ve juvenil bireylerden elde edilen 102,3 milyar temiz bazlık RNA dizileme verisi kullanılarak de novo transkriptom montajı gerçekleştirilmiştir. Ardından, farklı fekondite oranlarına sahip yedi teleost türüyle (D. rerio, G. aculeatus, O. niloticus, T. rubripes, T. nigroviridis, X. maculatus) karşılaştırmalı evrimsel analizler yürütülerek hamside pozitif seçilim gösteren genler ve bunların ovaryum spesifik ekspresyon örüntüleri belirlenmiştir(Eldem et al., 2023).
Araştırma Tasarımı
- Örneklem veya araştırma materyali
- Karadeniz bölgesindeki yerel balıkçılardan temin edilen 11,0-15,0 cm boyundaki erişkin dişi ve erkek hamsiler ile ODTÜ Deniz Bilimleri Enstitüsü tarafından sağlanan ortalama 3,5 cm boyundaki juvenil hamsiler materyal olarak kullanılmıştır. Toplamda 26 bireyden alınan ovaryum (3), testis (3), kuyruk (3), solungaç (3), yüzgeç (3), juvenil (5), kas (2), karacığer (2) ve böbrek (2) doku örnekleri analiz edilmiştir.
- Veri toplama süreci
- Doku örneklerinden TRIzol reaktifi ile toplam RNA izolasyonu yapılmış, RNA bütünlüğü Agilent 2100 Bioanalyzer ile kontrol edilmiştir. RNA-Seq kütüphaneleri hazırlanarak solungaç, yüzgeç ve kuyruk dokuları MGI DNBSEQ-400 platformunda, diğer tüm dokular ise Illumina HiSeq 2000 platformunda 100 bp çift uçlu (paired-end) olarak dizilenmiştir.
- Veri analiz yöntemi
- Ham okumalar fastp ile filtrelenmiş, Trinity yazılımıyla de novo montaj yapılmış ve BUSCO ile bütünlük değerlendirilmiştir. Diferansiyel gen ekspresyonu DESeq2 ile, fonksiyonel notasyon Trinotate ve TRAPID ile, ortolog tespiti ise Reciprocal Best Hits yöntemiyle yapılmıştır. Pozitif seçilim analizi için PAML CodeML programında branch-site modeli (dN/dS testi) kullanılmıştır.
Transkriptom ProfiliPozitif SeçilimFekondite (Yumurta Verimliliği)OogenezDiferansiyel Gen EkspresyonuTeleost Üremesi
01Yedi farklı balık türüyle yapılan karşılaştırmalı analiz sonuçunda, Avrupa hamsisinde toplam 535 genin pozitif seçilim altında olduğu tespit edilmiştir; bu genler hamsinin yüksek üreme kapasitesiyle ilişkili olabilecek evrimsel sinyaller taşımaktadır(Eldem et al., 2023).
02Pozitif seçilim gösteren genlerin (PSG) fonksiyonel zenginleştirme analizleri, bu genlerin büyük ölçüde RNA metilasyonu, ribozom biyogenezi, DNA tamiri, hücre döngüsü işleme ve peptid/amid biyosentezi gibi kritik hücresel süreçlerle ilişkili olduğunu göstermiştir(Eldem et al., 2023).
03Ovaryum dokusunda pozitif seçilim gösteren genlerin 58 tanesinin ekspresyonu artarken (up-regulated), 204 tanesinin azaldığı (down-regulated) belirlenmiş; yukarı regüle olan genlerin çoğunun RNA/DNA transferazları ve replikasyon faktörleri olduğu gözlenmiştir(Eldem et al., 2023).
04pnisr, prrc2b ve cdc6 genleri en yüksek istatistiksel anlamlılığa sahip pozitif seçilim sinyalleri sergilemiştir; özellikle cdc6 geninin oositlerin DNA replikasyon yeteneği ve hücre döngüsü düzenlemesindeki rolü hamsinin fekondite stratejisi için kritik önemdedir(Eldem et al., 2023).
05Ovaryum gelişiminde merkezi rol oynayan prmt5, gdf9, sox3, bmp15, figla, dnd1 ve zar1 gibi yedi temel protein kodlayan genin hamsi ovaryumunda diğer dokulara kıyasla anlamlı derecede yüksek ekspresyon gösterdiği doğrulanmıştır(Eldem et al., 2023).